A3P - Les méthodes de microbiologie rapides utilisant la cytométrie en flux

L’utilisation de méthodes de microbiologie rapides est de plus en plus fréquente dans les laboratoires industriels. Les sociétés pharmaceutiques, de cosmétique et de santé animale remplacent leurs méthodes à base de géloses par des méthodes rapides. Ces sociétés implantent des méthodes rapides pour leurs tests de microbiologie en routine afin de surveiller leurs systèmes de production d’eau purifiée, de tester la biocharge dans des intermédiaires de fabrication, de tester les matières premières et les produits finis et enfin de dénombrer des micro-organismes dans des cultures cellulaires. Il existe de nombreuses technologies de microbiologie rapide sur le marché telles que la bioluminescence ou l’ATPmétrie, la colorimétrie, l’impédancemétrie, la cytométrie à balayage laser et la cytométrie en flux. Du fait du nombre important de technologies rapides disponibles, cet article présentera essentiellement les avantages de la cytométrie en flux.

La cytométrie en flux est une méthode bien établie, communément utilisée en biologie cellulaire pour l’analyse rapide de cellules dans des suspensions microbiennes (Brehm-Stecher and Johnson 2004). En général, les échantillons sont préparés pour l’analyse en marquant les micro-organismes avec des sondes fluorescentes. Une fois que la réaction avec les marqueurs fluorescents est terminée, l’échantillon est injecté dans le cytomètre. Il pénètre alors dans la gaine liquide qui se déplace à une vitesse beaucoup plus rapide que celle à laquelle l’échantillon est introduit. La vitesse rapide du liquide de gaine permet de focaliser l’échantillon hydrodynamiquement en un flux très mince de cellules mono-disperses de manière à ce qu’un seul micro-organisme ne puisse passer devant le système de détection. Le flux d’échantillon arrive alors dans la cellule de détection où chaque cellule de l’échantillon est illuminée par un laser. Chaque cellule émet un signal de fluorescence induite par le laser et diffuse une partie de la lumière incidente. Cette lumière diffusée permet de déterminer la taille relative de chaque cellule par rapport aux cellules présentes dans l’échantillon.

Deux systèmes actuellement sur le marché utilisent le principe de la cytométrie en flux. Il s’agit du D-Count^®qui est fabriqué et commercialisé par la société AES Chemunex (Rennes, France) et du Micro PRO™ qui est fabriqué par la société Advanced Analytical Technologies (Iowa, USA) et commercialisé en France, en Belgique et en Espagne par la société Disruptive Technologies (Villecresnes, France). Ces instruments diffèrent des cytomètres de flux classiques de par leur niveau d’automatisation, leur facilité d’utilisation et le marquage propriétaire des micro-organismes par des sondes fluorescentes. Du fait que ces systèmes utilisent les concepts de base de la cytométrie en flux, ils permettent d’analyser et de dénombrer des cellules ou des micro-organismes dans des échantillons. Les résultats sont donnés en coups/ml, c'est-à-dire en nombre de cellules ou micro-organismes par millilitre, qui sont très bien corrélés aux résultats obtenus par la méthode classique sur gélose. De plus cette méthode permet de détecter et de dénombrer des micro-organismes viables mais non cultivables alors que la méthode classique donnera un résultat erroné sur ce type de micro-organismes.

Le Micro PRO™ est capable de différencier les micro-organismes tels que les bactéries, les levures, les moisissures mais aussi les formes sporulées et végétatives des bactéries et des champignons. Par conséquent le système peut dénombrer différents types de contamination microbienne dans un échantillon unique. Il peut aussi quantifier des micro-organismes de taille assez disparate (0,1 à 15 microns) et de concentration variable (1 à 6 log₁₀ cfu/ml) dans un échantillon.

Les systèmes basés sur la cytométrie en flux peuvent être utilisés pour des analyses quantitatives et qualitatives. En particulier, les analyses quantitatives incluent le dénombrement direct de micro-organismes dans l’eau purifiée, les intermédiaires de fabrication ou les cultures cellulaires intervenant dans les procédés de fermentation mais aussi celles utilisées au laboratoire. Les applications qualitatives nécessitent une étape d’enrichissement pour les matières premières, les intermédiaires de fabrication et les produits finis. Après enrichissement, les échantillons sont analysés pour déterminer la présence ou l’absence de contamination par des bactéries, des moisissures ou des levures.

L’avantage des méthodes de microbiologies rapides réside essentiellement dans la possibilité d’obtenir des résultats plus rapidement. Ces méthodes demandent généralement moins de travail que les méthodes classiques sur gélose et permettent d’obtenir les résultats en temps réel dans le cas où un enrichissement n’est pas nécessaire. Dans le cas où un enrichissement est indispensable, les résultats sont obtenus en 24 heures dans la plupart des cas. L’utilisation de la cytométrie en flux comme méthode rapide permet de dénombrer des micro-organismes de taille et de concentration très variable. Pour des raisons économiques, l’industrie remplace de plus en plus vite les méthodes classiques en vigueur par des méthodes rapides afin de diminuer leurs coûts mais aussi de prévenir les contaminations de leurs produits par de l’eau purifiée contaminée et ainsi mettre en place des actions correctives en temps réel. Par ailleurs la libération accélérée des lots de produits permet d’augmenter le service rendu aux clients.