Les avancées des Procédés de Hautes Pressions Hydrostatiques (HHP) dans l’obtention d’une assurance de stérilité de 10-6 : Principes & Applications pratiques

Comment a été initiée l’idée d’inactivation de micro-organismes par application de hautes pressions hydrostatiques ?
Le développement des procédés de hautes pressions hydrostatiques sur l’inactivation de micro-organismes peut être considéré comme une conséquence des premières expéditions océanographiques françaises de 1882 à 1883 [1].

En effet, la présence de micro-organismes vivants dans les sédiments prélevés lors de ces expéditions puis analysés par REGNARD [2] – l’un des collaborateurs de BERT – et CERTES [3] du laboratoire Louis Pasteur, impliquait que certains micro-organismes pouvaient survivre à des pressions au moins égales à 100 bar (10 MPa). ROGER [4], suite à cette première découverte, a été le premier à rechercher s’il était possible d’inactiver irréversiblement des micro-organismes à des valeurs de pression plus élevées.

A partir d’expériences avec un équipement pouvant atteindre environ 3000 bar (300 MPa) il a mis en évidence deux phénomènes importants :

  1. la différence de comportement entre divers micro-organismes à l’état végétatif (Streptococcus étant plus sensible à la pression que Staphylococcus aureus)
  2. la différence de sensibilité vis-à-vis de la pression pour le même micro-organisme Bacillus anthracis à l’état végétatif d’une part et à l’état sporulé d’autre part.

Ces premiers résultats peuvent être considérés comme la première étape du développement tant des travaux scientifiques que des applications industrielles des hautes pressions hydrostatiques dans le domaine de la biologie.

Les travaux sur l’impact des hautes pressions en biologie se sont ensuite développés de 1900 à 1985 dans divers pays [5]. Entre 1985 et 1990 sous l’égide du MITI (Japon), une action pluridisciplinaire a conduit à la première mise en oeuvre industrielle des procédés HHP dans l’agroalimentaire avec dès 1990 la mise sur le marché des premiers produits.
De cette période est issue “l’approche conventionnelle” des procédés HHP où 3 paramètres sont mis en oeuvre et permettent de décrire de tels procédés : 1) la valeur de la pression, 2) la valeur de la température et 3) la durée de traitement.

Le développement des procédés HHP dans le secteur des Biosciences et des Biotechnologies tant au niveau de la recherche qu’à celui du développement industriel

Le développement des procédés HHP dans le secteur de l’agroalimentaire a induit des recherches visant soit à accroître la qualité des produits ainsi traités, soit à accroître la valeur de la DLC. Ces travaux ont permis des avancées importantes notamment sur : 1) l’inactivation des micro-organismes, 2) les réactions enzymatiques et 3) les protéines.

Depuis ces 15 dernières années, des thématiques nouvelles ont été développées en Biotechnologies sur l’impact des Hautes Pressions Hydrostatiques concernant :

  • l’inactivation microbienne au sein de produits biologiques [6-8] [16-20],
  • la structure et la fonctionnalité des protéines [9],
  • les transitions sol-gel de macromolécules [10],
  • la modulation de l’activité enzymatique [11],
  • les mécanismes d’inactivation d’agents pathogènes tels que les virus et le développement de vaccins [12],
  • le “greffage” de molécules thérapeutiques sur des structures [13],
  • la dissolution/reprise d’activité biologique de protéines recombinantes [14].

Il faut cependant souligner que l’inactivation microbiologique par procédé HHP est l’une des problématiques les plus développées.

L’inactivation d’un micro-organisme dépend principalement de deux facteurs : la nature de la souche et la composition du milieu (certains constituants pouvant induire une certaine baro-résistance). Ce dernier facteur a été peu étudié et constitue un des axes de R&D en interne de HPBioTECH.

Les limites de “l’approche conventionnelle” des procédés HHP dans l’inactivation des micro-organismes et la nécessité d’une nouvelle approche

“L’approche conventionnelle” nécessite pour l’inactivation irréversible des espèces végétatives des pressions très élevées (500-600 MPa). Bien que développant une faible énergie par rapport aux procédés thermiques, les procédés HHP mettant en oeuvre ces pressions élevées conduisent dans la plupart des cas à l’altération des fonctionnalités des produits ainsi traités (propriétés thérapeutiques notamment).
Afin de contourner ce verrou, HPBioTECH a été amenée à définir une nouvelle approche des procédés HHP, ce qui a déjà fait l’objet de plusieurs brevets.

Le challenge consistait à accroître l’inactivation des micro-organismes (espèces végétatives et extension à l’inactivation de spores bactériennes) dans une gamme de pressions modérées : 350-400 MPa. Il a été mis en évidence que le contrôle de l’application de la pression tant au niveau de la vitesse d’application VA qu’à celui du mode d’application MA (notamment dans le cas d’applications cycliques) permettait d’accroître notablement l’efficacité destructrice ED et donc de limiter considérablement la valeur de la pression (350-400 MPa) requise. En outre, en optimisant l’ensemble des paramètres de procédé HHP d’une part et en introduisant un temps de latence entre chaque cycle d’autre part, il était possible d’induire la germination de spores bactériennes (notamment celles du genre Bacillus) durant le traitement HHP et ainsi de les inactiver [15].

Figure 1 : application de hautes pressions hydrostatiquesFigure 1 bis : application de hautes pressions hydrostatiques

Figure 1 – Formes végétatives de C.albicans et S.aureus avant et après traitement HHP

L’équipement HHP mis en oeuvre pour développer de tels procédés
La figure 2 représente un équipement de type pilote capable de développer la nouvelle approche constituée de 4 principaux éléments (de gauche à droite) :

  • un régulateur de température (A)
  • l’enceinte hautes pressions” thermostatée (B),
  • le groupe de compression (C),
  • le dispositif permettant de gérer l’application de la pression (paramètres VA et MA) (D).

Ces équipements existent également à l’échelle industrielle, en approche conventionnelle ou en nouvelle approche selon les fabricants.


Finalisation du cycle de stérilisation par HHP

1. Finalisation du conditionnement
Un procédé HHP nécessite l’utilisation de conditionnements souples (par exemple des poches), ou dont une partie du conditionnement est souple (par exemple des flacons en verre col large avec un bouchage en élastomère). Il existe aujourd’hui des conditionnements adaptés aux procédés HHP, notamment des conditionnements multicouches qui préviennent le risque de migration des constituants du conditionnement au niveau du produit sous l’effet de la pression.
Selon les cas, des conditionnements standards sont utilisés, ou des conditionnements spécifiques sont développés, adaptés à l’usage prévu pour le produit.

2. Finalisation du cycle HHP
Cette étape est de très loin l’étape cruciale. Tout repose sur l’expertise en matière de développement des cycles de stérilisation pour identifier les bons paramètres parmi les 6 applicables à la nouvelle approche : 1) la pression, 2) la vitesse d’application, 3) la vitesse de décompression, 4) le nombre de cycles, 5) la durée de chaque cycle et 6) le temps de latence.

Le produit à stériliser, conditionné dans le packaging final puis placé au sein de la chambre de stérilisation, dans un liquide vecteur qui est généralement de l’eau. Le packaging doit être inaltéré dans les conditions HHP de stérilisation. L’énorme avantage des HHP est que le liquide répartit la pression de façon homogène en tout point de l’enceinte.
Les temps de stérilisation sont généralement courts, de quelques minutes à une heure environ selon les cas.

Figure 2 : application de hautes pressions hydrostatiquesFigure 2 – Installation pilote HHP

3. Identification du germe le plus difficile à détruire
Les études réalisées prouvent que ce germe est fonction du produit à traiter. Néanmoins, s’il n’existe pas de germe de référence valable pour tous les produits, le germe le plus difficile à détruire appartient à une liste limitative de souches résistantes aux traitements HHP, comme par exemple le Bacillus cereus ATCC 14579 (forme sporulée) ou Staphylococcus aureus ATCC 6538. Une fois identifié, ce germe est utilisé comme germe de référence pour les essais de validation.

Bien évidemment, ce germe est régulièrement challengé par rapport au bioburden des produits à stériliser et la flore résidente des locaux de production, afin de prouver que ce germe reste le plus défavorable à stériliser.

4. Définition de l’équipement de stérilisation
Le besoin utilisateur relatif à l’équipement de stérilisation tient compte de plusieurs paramètres, dont :

  • Les paramètres de traitement HHP de 1) à 6),
  • Le volume de traitement par cycle,
  • L’implantation de l’équipement en zone de production,
  • La régulation de température souhaitée (généralement inférieure à 45°C),
  • etc.

Il est à noter que le volume de l’enceinte n’aura aucun effet sur la pression, qui restera toujours homogène, alors qu’il aura un effet sur l’homogénéité de température, plus difficile à réaliser pour des enceintes de gros volume, comme pour n’importe quel équipement à température régulée.

Néanmoins, ce phénomène reste limité pour plusieurs raisons :

  • Les températures paramétrées sont voisines de la température ambiante (maximum 45°C),
  • Les écarts de température sont largement limités par le pouvoir de tampon thermique de l’eau, qui est la matière qui présente la plus forte chaleur massique comme chacun sait, et donc qui présente le plus grand pouvoir de tampon thermique.

5. Validation du cycle de stérilisation
Une méthodologie innovante et sous dépôt de Brevet [21] permet de démontrer une réduction de 12 logs de contamination, soit un NAS de 10-6 si la contamination initiale est inférieure ou égale à 106 UFC / contenant avant stérilisation. Pour des raisons de confidentialité, la présente méthode ne sera pas dévoilée dans cet article, de même que la nature des produits en cours de test.
Cette méthode est appliquée sur le germe prouvé comme étant le plus difficile à détruire pour le couple cycle-produit considéré.

Figure 3 : application de hautes pressions hydrostatiques

Figure 3 – Validation du NAS de 10-6

Conclusion
Les procédés HHP dans cette nouvelle approche permettent de stériliser des produits aujourd’hui inaccessibles à tout procédé de stérilisation et pour lesquels la répartition aseptique n’est pas non plus envisageable. Il s’agit notamment des produits visqueux non filtrables. Ces procédés constituent également une alternative économique intéressante aux procédés de fabrication par répartition aseptique, plus onéreux et plus risqués du fait de l’absence de stérilisation finale.
Ils constituent une voie d’avenir, d’autant qu’une méthode innovante de validation de stérilisation permet de démontrer aujourd’hui un NAS de 10-6.

Biron

Jean-François BIRON – AExiqual

Pharmacien, JF Biron a travaillé d’abord comme responsable de production dans un groupe de soustraitance en stérilisation Depuis 23 ans, il exerce comme consultant.
Fondateur de la société AExiqual, il a finalisé une méthode de validation de la stérilisation qui permet de démontrer un SAL de 10-6 pour les procédés par Hautes Pressions Hydrostatiques.

jf.biron@aexiqual.com

Demazeau

Gérard DEMAZEAU – HPBioTECH

Dr. ès Sciences, Professeur à l’Université de Bordeaux et Professeur Emérite.
Lauréat de l’Académie des Sciences (Prix Paul Pascal 1986) et Lauréat de l’International Solvothermal Hydrothermal Association (Lifetime Achievement Award 2014), il est l’auteur d’environ 600 publications dans diverses revues scientifiques internationales. Co-fondateur de la Société HPBioTECH, il a mis au point une nouvelle approche des procédés de Hautes Pressions Hydrostatiques permettant d’assurer une meilleure sécurisation microbiologique tout en préservant les propriétés caractéristiques des produits traités.

gdemazeau@hpbiotech.fr

Plumecocq

Adrien PLUMECOCQ – HPBioTECH

Titulaire d’un master en Biochimie et Chimie Analytique, il a effectué son stage de fin d’étude dans un laboratoire de Biomatériaux (LIOADINSERM) sur l’étude de matériau injectable. Il a acquis une expérience industrielle dans une entreprise pharmaceutique (LFB). Depuis 3 ans, il a intégré, en tant que ingénieur R&D, la société HPBioTECH.

aplumecocq@hpbiotech.fr

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Références

[1] M. GRUVEL, L. JOUBIN, A. VAYSSIERE, R. PERRIER (2002), Expéditions scientifiques du Travailleur et du Talisman, Cirrhipèdes, Némertiens, Opistobranches, Holothuries, Masson Paris.

[2] P. REGNARD (1884), Recherches expérimentales sur l’influence des très hautes pressions sur les organismes vivants. C.R. Heb. Acad. Sci., 98, p.745-747.

[3] A. CERTES (1884), Note relative à l’action des hautes pressions sur la vitalité des micro-organismes d’eau douce et d’eau de mer. C.R. Soc. Biol., 36, p.220-222.

[4] H. ROGER (1895), Action des hautes pressions sur quelques bactéries. Arch. Physiol. Norm. Path., 7, p. 12-17.

[5] G. DEMAZEAU, N. RIVALAIN (2011), High hydrostatic and biology: a brief history. Appl. Microbiol. Biotechnol., 89, p.1305-1314.

[6] B. HITE, N.J. GIDDINGS, C.E. WEAKLEY (1914), The effect of pressure on certain micro-organisms encountered in the preservation of fruits and vegetables, Bull West Virginia Univ. Agric. Exp. Station, 146, p.1-67.

[7] D.G. HOOVER, G. METRICK, A.M. PAPINEAU, D.F. FARKAS, D. KNORR (1989), Biological effects of high hydrostatic pressure on food micro-organisms. Food Technol., 43, 99-107.

[8] G. DEMAZEAU, N. RIVALAIN (2011), The development of high hydrostatic pressure processes as an alternative to other pathogen reduction method. J. of Applied Microbiology, 110 (6), p.1359-1369.

[9] V.V. MOZHAEV, K. HEREMANS, J. FRANK, P. MASSON, C. BALNY (1994), Exploiting the effects of high hydrostatic pressure in biotechnological applications, Trends in Biotechnology, 12(12), p.493-501.

[10] K. GEKKO (1992) in : High Pressure and Biotechnology (Eds.:C. BALNY, R. HAYASHI, K. HEREMANS, P. MASSON), Colloque INSERM, 224, p.105-112 (John Libbey).

[11] D.B. NORTHORP (2002), Effects of high pressure on enzymatic activity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA), Protein Structural and Molecular Enzymology, 1595 , p.71-79.

[12] J.L. SILVA, S.P.C. BARROSO, Y.S. MENDES, C.H. DUMARD, P.S. SANTOS, A.M.O. GOMES, A.C. OLIVEIRA (2015), Pressure-inactivated virus: a Promising Alternative for Vaccine Production in “High Pressure in Bioscience: Basic concepts, Application and Frontiers” Chapître 15.

[13] J. NEGISHA, K. NAM, T. KIMURA, T. FUJISATO, A. KISHIDA (2010), High Hydrostatic Pressure is an effective method for the preparation of PVA-Heparin hybrid gel. Eur. J. Pharm. Sci., 41, p.617-622.

[14] J.F. CARPENTER, L.K. HESTERBERG, T.W. RANDOLPH (2005), High Pressure Disaggregation and Folding of Recombinant Proteins. Bioprocess International, may 2005, p.46-53.

[15] G. DEMAZEAU, N. RIVALAIN (2012), Procédé de traitement sous hautes pressions d’un milieu pour l’inactivation de spores bactériennes. Brevet Fr.12 60214 délivré par l’INPI le 27.01.17

[16] V.H. HOLSINGER, K.T. RATKOWSKI, J.R. STABEL (1997), Milk pasteurization and safety: a brief history and update. Rev. sci. tech. off int. epiz, 16 (2), p.441-451.

[17] S. NOTERMANS, T. DUFRENNE, P. TEUNIS, R. BEUMER, M. te GIFFEL, P. PEETERS WEEM (1997), A risk assessment study of Bacillus cereus in pasteurized milk. Food Microbiology, 14, p.143-151.

[18] G. DEMAZEAU, N. RIVALAIN, C. BILLEAUD (2012), Procédé de traitement sous hautes pressions de lait maternel. Brevet N° Fr.12.60105 délivré par l’INPI le 26.12.2014.

[19] M. D’ESTE, A. PLUMECOCQ, M. ALINI, G. DEMAZEAU (2017), High Hydrostatic Pressure for the decontamination of soft Biomaterials. European Cells and Materials (en cours de parution).

[20] G. DEMAZEAU (2014), Procédé de traitement de produits cosmétiques sous hautes pressions hydrostatiques. Brevet N° Fr.14.52776 délivré par l’INPI le 3 février 2016.

[21] J.F. BIRON (2016)., Validation d’un procédé de stérilisation. Dépôt de Brevet reçu à l’INPI le 15 novembre 2016 sous le n°16.01614.