La détection d’une contamination mycoplasmique est par conséquent critique dans les différentes étapes de production des produits biotechnologiques. Récemment, l’utilisation de différentes techniques d’amplification des acides nucléiques et en particulier de la PCR quantitative en temps réel pour détecter des mycoplasmes a été décrite dans différents rapports des Pharmacopées Européenne, Américaine et Japonaise. Ces rapports ont confirmé l’utilisation de ces méthodes comme alternatives aux méthodes conventionnelles à la condition d’être convenablement validées.

La qPCR est une méthode directe sensible et rapide permettant d’obtenir un résultat dans la journée. En comparaison, la méthode standard réglementaire (méthode directe par culture sur milieux broth et agar dans différentes conditions) nécessite un délai de 28 jours.
Pour utiliser cette technique très rapide en routine, la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur. 2.6.7) impose la réalisation d’une étude de validation détaillée pour démontrer l’équivalence avec la méthode réglementaire. Le design de cette qualification s’articule autour de trois critères : la limite de détection (LOD: 10 CFU/ml), la spécificité ainsi que la robustesse.

La méthode indirecte par marquage fluorescent (type Hoechst) après une phase de culture de l’échantillon sur cellules indicatrices (Vero) permet de détecter des mycoplasmes non cultivables avec la méthode de bactériologie (notamment M. hyorhinis ATCC 29052). Elle permet aussi de mettre en évidence des mycoplasmes vivants par opposition à la PCR qui amplifie indifféremment l’ADN de mycoplasmes morts et vivants contenus dans un échantillon.

LES MYCOPLASMES DANS LES BIOTECH
Les cellules aujourd’hui sont devenues des outils indispensables pour produire un nombre croissant de produits bio-thérapeutiques : protéines recombinantes, anticorps monoclonaux, vaccins ainsi que les thérapies géniques et cellulaires. En parallèle, les tests cellulaires (Cell Based Assays) accompagnent le développement et la mise sur le marché de ces produits.

Une contamination mycoplasmique en général non visible (pas de turbidimétrie) peut potentiellement provoquer de nombreux désordres dans la physiologie cellulaire (taux de croissance, rendement de production,…) sur un large spectre de cellules hôtes : humaines et animales (incluant les oiseaux, les mammifères et d’autres espèces potentielles : insectes, plantes). De plus certaines espèces de mycoplasmes sont pathogènes pour l’homme.

Le test réglementaire référencé dans les principales pharmacopées est une méthode de détection directe des mycoplasmes par culture pendant 28 jours sur des milieux spécifiques (Broth et Agar). Ce long délai de rendu de résultat pose problème pour des produits bio-thérapeutiques avec une courte période de vie comme par exemple la thérapie cellulaire. Cela pose aussi un autre problème car certaines espèces de mycoplasmes “poussent” très mal voire pas du tout sur ces milieux spécifiques.

Lors du déroulement des étapes successives de production, un contrôle “in–process” pour la détection des mycoplasmes par qPCR permet de limiter les risques de propagation d’une contamination sur les étapes suivantes et de prendre une décision rapide et sûre (“go/ no-go”) pour la suite du processus.

De surcroît, une contamination peut potentiellement avoir des conséquences sérieuses pour le laboratoire ou l’unité de production si on n’identifie pas rapidement la cause racine (“root cause”).

Cette méthode de culture sur 28 jours peut aussi être inappropriée pour des échantillons cytotoxiques ou pour des échantillons “in-process” nécessitant un rendu de résultat rapide et sûr. C’est en partie pour ces raisons que certaines autorités réglementaires acceptent comme alternative l’utilisation du test de détection par PCR quantitative en temps réel au cas par cas. Cette acceptation nécessite une validation complète et documentée selon des guidelines spécifiques (Ph. Eur.2.6.7).

Quels sont donc les challenges, les enjeux et les perspectives de la mise en place de ce test par PCR quantitative en temps réel en remplacement de la méthode classique ?
La plupart des autorités réglementaires : European and United States Pharmacopeia (Ph. Eur. & U.S.P.), US Code of Federal Regulations (CFR), FDA Points to Consider (PTC), the International Conference on Harmonisation (ICH), intègrent des documentations techniques sur les procédures requises pour la détection des mycoplasmes durant les différentes étapes de production.

Les principaux référentiels décrivant les méthodes de détection sont :
• EP 2.6.7, U.S.P. <63>
• Japanese Pharmacopoeia XV Information Chapter 14
• 21 CFR 610.30 for human viral vaccines
• US FDA’s Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals
• 2010 Cell Substrates Guidance ainsi que pour les produits vétérinaires : 9 CFR 113.28 for Veterinary Products

Pour la validation du test, les principaux cadres règlementaires sont :
• EP 2.6.7, U.S.P.<1223>
• EP 5.1.6, 21 CFR §610.9
• JP XV General Notice 13

Ainsi pour rendre un résultat avec la méthode de PCR quantitative en temps réel, une validation doit être réalisée pour démontrer l’équivalence avec la méthode réglementaire par culture. La Pharmacopée Européenne (Ph. Eur. 2.6.7) définit le design d’une telle étude avec des paramètres spécifiques à valider: LOD avec 10 CFU/ mL, spécificité et robustesse.

Le nouveau laboratoire SGS Life Science Services propose en routine et dans un environnement GMP dédié, la détection des mycoplasmes par la méthode qPCR et par la méthode sur cellules indicatrices Vero (marquage Hoechst). Ce nouveau service vient renforcer notre volonté d’offrir à nos clients des services complets et innovants pour leurs produits biologiques (thérapeutiques, diagnostiques, vétérinaires) tout en complétant nos services dédiés à l’ensemble de l’Industrie Pharmaceutique et BioPharmaceutique.

Pour démontrer que la sensibilité de la méthode qPCR est au moins égale à la méthode réglementaire, cette validation doit être réalisée dans un environnement contrôlé avec l’utilisation de souches mycoplasmes spécifiques. L’Agence Européenne indique en effet l’importance d’utiliser des stocks de mycoplasmes avec un ratio bas pour le rapport nombre de copie du génome /CFU (GC/CFU ratio) afin de comparer directement les LODs obtenues par les deux méthodes.

En résumé, le choix de la méthode de détection la plus adaptée dépend spécifiquement du produit biologique ainsi que de son procédé de fabrication. Une évaluation scientifique et technique est nécessaire pour déterminer la ou les méthode(s) la plus appropriée selon le type d’échantillon, il peut être nécessaire et pertinent d’utiliser deux méthodes. Ces considérations devront au final être potentiellement intégrées dans le dossier spécifique du produit biologique.

Comparaison des 3 principales techniques :
Ces différents critères sont donc importants à prendre en compte dans le développement et l’élaboration du “risk assessment” pour choisir la méthode la plus adaptée à chaque produit.