Sommaire
- Gene therapy manufacturing comes of age: Commercial-scale manufacturing is imminent. Are gene therapy innovators ready?
- Overcoming obstacles in downstream bioprocessing of AAV based gene therapy products
- Overcoming challenges in the development of lentiviral vector manufacturing platforms
- Are modern scalable bioreactors the Cell Culture Strategy needed for Gene & Cell Therapy success?
- Le pouvoir magnétique des nanoparticules triage magnétique cellulaire dépollution des milieux et nano catalyseurs réutilisables
- Développement d’une nouvelle approche préventive pour réduire les infections microbiennes avec les nanoparticules d’oxydes métalliques
- Surveillance numérique de l’environnement : détecter les défaillances avant qu’elles ne se produisent
- Maximizing Sterility Assurance: Sterile Hold Time Testing for Sterilized Items Used in Parenteral Drug Manufacturing
Développement d’une nouvelle approche préventive pour réduire les infections microbiennes avec les nanoparticules d’oxydes métalliques
La prolifération de bactéries pathogènes multirésistantes est considérée comme un véritable défi de santé dans le monde entier[1]. Les maladies infectieuses associées aux biofilms représentent plus de 80% des infections microbiennes dans l’organisme, entraînant une augmentation de la morbidité des patients et la prise en charge hospitalière/ médicale[2,3].
L’avancée dans le domaine des nanobiotechnologies, en particulier la capacité à préparer des nanomatériaux à base d’oxyde métalliques de taille et de forme spécifiques, sont susceptibles de conduire au développement de nouveaux agents antibactériens. Le projet EBiocide a germé de la volonté de développer des nanomatériaux avec des activités biocides pour des applications en couches minces, ce qui permettrait d’apporter une réponse aux problématiques d’infections nosocomiales et d’autres applications biomédicales et industrielles. Ces derniers étant considérés comme des agents prometteurs contre la diffusion des microorganismes résistants aux antibiotiques traditionnels en raison de leurs propriétés antimicrobiennes à large spectre. En effet, la disponibilité d’une large surface spécifique et leur taille confèrent à ces matériaux des mécanismes antimicrobiens unique comprenant principalement : la génération d’espèces réactives à l’oxygène (ERO) ; la libération d’ions métalliques et la destruction de la membrane cellulaire par contact direct[4]. Ces multiples mécanismes, d’origine physique et chimique, réduiraient donc l’apparition de résistance de la part des microorganismes.
Les travaux initiaux ont été portés sur la synthèse de nanoparticules d’oxydes métalliques (ZnO, CuO) sous forme de colloïdes et sous forme de couches minces afin d’évaluer leurs activités antibactériennes pour des applications industrielles. Nous avons effectué les tests de cytotoxicité des NPs sur des cellule fibroblastes dermiques, les premiers résultats ne montre pas d’effet toxique sur les cellules, d’autres tests sont en cours. Concernant la résistance mécanique, nous l’avons effectué sur des couches minces avec un traitement thermique à 500 °C, bonne résistance, mais cela doit être effectuer dans les conditions réelles de formulation. La finalité est l’utilisation de ces nanomatériaux pour la décontamination de surfaces notamment dans le milieu hospitalier et autres applications industrielles. La Figure 1 présente le schéma synoptique de l’approche globale adoptée pour le développement de ces nanomatériaux biocides .
1. Synthèse des nanoparticules et couches minces de CuO et ZnO
La méthode sol-gel a été utilisée pour la synthèse des NPs de CuO et de ZnO. Les solutions de CuO et de ZnO sont préparées à l’intérieur d’une boîte à gants à partir de l’acétate de zinc di hydraté et de l’acétate de cuivre monohydraté dissout dans un mélange d’isopropanol et de monoethanolamine (MEA) utilisés comme solvant et stabilisateur respectivement (figure 2). Les couches minces ont été préparées par dip-coating sur des plaques de verre après une préparation de surface préalable avec de l’acide sulfurique. Les couches minces préparées ont été traitées thermiquement à 500°C pendant une heure.
Nous avons obtenu des tailles moyennes de l’ordre de 3 nm pour les deux oxydes sous forme colloïdale. Pour ce qui est des couches minces, l’analyse par microscopie électronique à balayage (MEB) met en évidence que les dépôts formés pour CuO et ZnO sont constitués de particules de diamètre proche de 30-40 nm, ces films sont homogènes, denses et formés de particules sphériques. Les résultats de ces caractérisations confirment la présence d’une couche mince d’oxyde de zinc et d’oxyde de cuivre, la figure 3 présente les couches minces obtenues.
2. Les tests d’activités antibactériennes des Nps en solution colloïdale et couche minces
Nous avons utilisé la méthode de disque de diffusion en premier lieu pour réaliser un screening de la sensibilité antibactérienne aux nanoparticules. Pour ces tests, nous utilisons les NPs en suspension, et donc sous une forme amorphe. Les disques de papier (6mm de diamètre) sont imbibés avec une solution colloïdale de NPs à différentes concentrations avec un volume de 20μL, ensuite déposés à la surface des boîtes de Pétri qui sont inoculées par différentes suspensions bactériennes à une concentration de 107 UFC/mL, puis incubées pendant 24h à 37°C pour garantir des conditions optimales de croissance des souches. La concentration minimale à laquelle les nanoparticules présentent des activités antimicrobiennes est appelée concentration d’inhibition minimale (CMI) et la zone autour du disque où aucune croissance bactérienne n’est observée et appelée la zone d’inhibition. Un disque imbibé uniquement de solvant sert quant à lui de témoin (Photo1). La sensibilité microbienne des nanoparticules d’oxydes métalliques varie selon les espèces microbiennes et les concentrations d’oxydes métalliques.
Les résultats obtenus sont représentés par la figure 4 :
Les résultats montrent que les sols de nanoparticules de CuO et de ZnO se comportent comme des agents antibactériens avec la présence de zones d’inhibition. Les nanoparticules de ZnO inhibent les bactéries uniquement à des concentrations suffisamment élevées, environ 0,5 M, tandis que le comportement antibactérien des nanoparticules de CuO commence à une concentration plus faible. Ces résultats ont été confirmés par la méthode d’ATPmétrie, des concentrations des sols de nanoparticules similaires à celles de la méthode de diffusion sur disque ont été utilisées. Les mesures ont été réalisées dans des plaques à 96 puits après avoir déposé dans chaque puits 50 μL de suspension bactérienne à 109 UFC/mL et 50 μL de solution de NPs. Les mesures instantanées d’ATP dans les solutions de NPs de ZnO et de CuO convergent vers zéro pour les trois souches bactériennes. Le témoin positif (suspensions bactériennes sans NPs) a été mesuré comme référence pour chaque souche. La figure 5 montre une valeur élevée d’ATP au contrôle positif avec toutes les souches en phase stationnaire.
L’intensité RLU des témoins sans bactéries sont très élevées, et nous constatons un abattement important sur les histogrammes rouge et bleue dans la figure 5. En revanche une forte diminution du signal d’ATP a été observée avec tous les échantillons en contact avec des NPs de ZnO et de CuO, ce qui met en évidence leur effet antibactérien. Pour les tests antibactériens sur les couches minces, nous avons développé une méthodologie permettant l’évaluation de l’activité antibactérienne sous forme de couches minces en nous inspirant de la norme européenne NF EN 14561 (2007-03)[7], nous avons validé notre méthode avec les couche minces de ZnO, CuO et TiO2 sur les souches bactériennes de référence utilisées dans ce travail[8] comme le montre la figure 6.
Les résultats obtenus après incubation des lames sont présentés dans la figure 7 et montrent une diminution de la viabilité des souches étudiées quand elles sont en contact avec les NPs de ZnO et CuO. En effet, on observe aucune croissance bactérienne sur les géloses dans lesquelles les lames de couches minces de NPs ont été disposées. Les résultats montrent que les couches minces de nanoparticules présentent une forte activité antibactérienne. On note une suppression de 5 log de la population bactérienne déposée pour les 3 souches étudiées.
Conclusion
Les NPs de ZnO et CuO en solution présentent un effet antibactérien vis à vis des souches de bactéries à Gram-positif (Staphylococcus aureus) et à Gram-négatif (Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa). Les résultats des tests antibactériens sur les couches minces montrent une efficacité antibactérienne de l’ensemble des NPs sur les différentes souches étudiées avec une réduction de 5 log de la population bactérienne.
Plusieurs perspectives sont envisagées pour la poursuite de ces travaux :
- Elargir ces tests vers les espèces fongiques et virus.
- Etudes de l’effet de la taille des nanoparticules sur l’activité antibactérienne
- Réaliser des formulations avec ces nanoparticules pour aboutir à des produits avec des propriétés antibactériennes (peintures, packaging…).
- Réaliser et optimiser les tests sur des prototypes sous forme de couches minces.
- Croiser ces résultats avec la thématique concernant les biopolymères dans le but de développer des biomatériaux antibactériens.
Réferences
[1] Izunna S. Okeke, Kenneth K. Agwu, Augustine A. Ubachukwu, Fabian I. Ezema, Influence of transition metal doping on physiochemical and antibacterial properties of ZnONanoparticles: A review, Applied Surface Science Advances,Volume 8,2022,100227
[2] L. Hall-Stoodley, J. W. Costerton, and P. Stoodley, « Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases », Nature Reviews Microbiology, vol. 2, no. 2, pp. 95-108, 2004.
[3] P. Watnick and R. Kolter, « Biofilm, city of microbes », Journal of Bacteriology, vol. 182, no. 10, pp. 2675-2679, 2000.
[4] S. Kheiri, X. Liu, M. Thompson, Nanoparticles at biointerfaces: Antibacterial activity and nanotoxicology, Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, Volume 184,2019,110550, ISSN 0927-7765.
[5] Rania Dadi. Synthèse de nanoparticules d‘oxydes métalliques et leur activité antibactérienne. Matériaux. Université Paris-Nord – Paris XIII, 2019
[6] R. Dadi, R.Azouani, M.Traore, C. Mielcarek, A. Kanaev. Antibacterial activity of ZnO and CuO nanoparticles against gram-positive and gram-négative strains. Materials Science and Engineering: C,Volume 104,2019,109968,ISSN 0928-4931
[7] Norme NF 14651, Agence Française de Normalisation, Décembre 2007
[8] C. Mielcarek, R. Dadi, A. Roynette, A. Lemarchand, A.Kanaev, K. Senni, M.Traore, R. Azouani. Antibacterial Activity Evaluation of ZnO, CuO, and TiO2 Nanoparticles in Solution and Thin Films Bioluminescence, 2022, Volume 2525.ISBN : 978-1-0716-2472-2
Glossaire
ATP : adénosine triphosphate
CMI : concentration minimale inhibitrice
CuO : nanoparticules d’oxyde de cuivre
ERO : espèces réactives à l’oxygène
MEA : monoethanolamine
NPs: nanoparticules
RLU : unité de luminescence relative
TiO2 : nanoparticules d’oxyde de titane
UFC : unité formant colonie
ZnO : nanoparticules d’oxyde de zinc
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Imroi EL-HABIB, Anne ROYNETTE, Christine MIELCAREK, Alex LEMARCHAND & Mamadou TRAORE &
Rabah AZOUANI
