1. Les différentes applications de l’évaluation de la biocharge

Le terme de biocharge est souvent utilisé dans des cadres et pour des applications différentes :

• La vérification de la biocharge avant stérilisation ou remplissage aseptique pour un produit stérile pharmaceutique
• La vérification de la biocharge durant la production (In Process Control)
• La vérification de la biocharge avant stérilisation ou dans le cadre de la validation périodique d’un processus de stérilisation pour des dispositifs médicaux
• La vérification de la biocharge des matières premières à usage pharmaceutique
• La réalisation des dénombrements de germes pour les produits non stériles

À mon sens, la meilleure définition de ce test est une quantification de la flore microbiologique totale qui comprend :

• Le dénombrement des germes aérobies totaux (DGAT)
• Le dénombrement des germes anaérobies totaux (DGAnaT)
• Le dénombrement des moisissures et des levures totales (DMLT)

La recherche des germes anaérobies peut être discutable. Dans tous les cas, une analyse de risque est à réaliser afin de définir la flore à rechercher.

2. Réglementation relative au bioburden.
Plusieurs textes, lignes directrices ou réglementations encadrent les attendus de l’évaluation de la biocharge (cf bibliographie). L’ensemble de ces réglementations définit un cadre afin de limiter et de maitriser au maximum la charge microbienne avant stérilisation. Les principales sources de contamination sont :

• Les matières premières
• L’environnement de production
• Le processus de fabrication : impact de la présence humaine
• L’eau à usage pharmaceutique

3. Les limites de la biocharge
Conformément à l’annexe 1 des BPF : “La biocharge (contamination microbienne) doit être contrôlée avant la stérilisation. Une valeur limite doit être fixée pour la contamination microbienne immédiatement avant la stérilisation, limite qui est fonction de l’efficacité de la méthode utilisée. La détermination de la biocharge doit être réalisée sur chaque lot qu’il soit produit aseptiquement ou stérilisé dans son conditionnement final.”
La limite de la biocharge est donc à définir pour chaque produit et production.
Dans la Note for guidance on manufacture of the finished product CPHMP/QWP/486/95 1996 deux limites sont indiquées :

• 10 CFU / 100mL dans le cadre d’une filtration stérilisante
• 100 CFU / 100 mL ou g pour une stérilisation par la chaleur

La révision de cette guidance (EMA/CHMP/QWP/245074/2015) en 2017 indique que les limites doivent être adaptées en fonction du produit.

4. Méthode de réalisation de la biocharge
Il n’existe pas de chapitre spécifique au test de bioburden. Généralement les essais de biocharge sont réalisés selon le chapitre 2.6.12 “Contrôle microbiologique des produits non stériles : essais de dénombrement microbien.” de la pharmacopée européenne. La méthode de la filtration membranaire permet l’analyse des 100mL de produit. Dans le cas ou la filtration des 100mL n’est pas possible une analyse d’un minimum de 30mL est possible avec justification. Après filtration, le filtre est déposé sur milieu de culture aux peptones de caséine et soja, puis incubé en présence d’air pour les DGAT et en anaérobiose pour les DGanaT pendant 5 jours à 30-35°C.
Pour les levures et moisissures trois options sont possibles :

• La réalisation de l’analyse en combinaison avec les DGAT si la méthode a été validée dans ce cadre.
• La réalisation de l’analyse en combinaison avec les DGAT avec une incubation à 30-35°C puis à 20-25°C si la méthode a été validée dans ce cadre.
• La réalisation d’une autre filtration avec dépôt du filtre sur milieu Sabouraud avec une incubation 5 à 7 jours à 20-25°C.

5. Validation de la méthode
Par abus de langage, on parle de validation de méthode pour l’essai de biocharge. En réalité, il s’agit d’un essai d’applicabilité. Lors de l’essai d’applicabilité de la méthode, des micro-organismes de référence sont ajoutés afin de vérifier que la méthode permet de les mettre en évidence.
De base les micro-organismes de référence suivants sont testés :

• Staphylococcus aureus
• Escherichia coli
• Bacillus subtilis
• Candida albicans
• Aspergillus brasiliensis
• Clostridium sporogenes (si les bactéries anaérobies sont recherchées)

En plus des micro-organismes de références, il est recommandé de tester des micro-organismes endogènes. Ces micro-organismes sont généralement issus de la production (obtenus lors du monitoring) ou ont provoqué un résultat hors des spécifications.

6. Evaluation de la biocharge un test en nuance de gris
Pour les analyses de biocharge, le terme évaluation prend tout son sens. Il y a bien des limites en fonction des applications ou des stades de fabrication, mais le bioburden n’est pas un test uniquement quantitatif. L’identification de la biocharge est aussi importante, car elle permet d’aider à :

• Connaître la flore microbienne
• Définir le risque pyrogène
• Définir le risque de résistance à la stérilisation

7. Connaissance de la flore microbienne
L’évaluation de la biocharge permet de mieux connaître et maîtriser la flore microbienne du produit. Lors de l’analyse de la biocharge des premiers lots de production, il est recommandé d’identifier l’ensemble des micro-organismes retrouvés. Une identification complète permettra de contrôler et de définir la flore normale du produit. Les premiers essais permettent aussi l’établissement d’une limite d’alerte. La réévaluation périodique de la nature de la biocharge permet aussi de vérifier l’évolution de cette dernière et participe à la définition des micro-organismes endogènes.

8. La biocharge et le risque pyrogène
Depuis la mise à jour du chapitre 5.1.10 “Recommandations pour la réalisation de l’essai des endotoxines bactériennes” il est nécessaire d’évaluer le risque relatif à l’ensemble des substances pyrogènes. Les micro-organismes sont une source majeure de pyrogènes. L’analyse qualitative de la biocharge permet d’aider à évaluer le risque pyrogène. La présence de bactérie gram négative (par exemple Pseudomonas ou Enterobacteriaceae) peut indiquer un risque relatif aux endotoxines. La présence de bactérie gram positive (par exemple Staphylococcaceae, ou Bacillaceae), de levures ou moisissures peut indiquer un risque de non endotoxines pyrogènes (NEP).

9. La résistance à la stérilisation
Les micro-organismes ont une résistance à la stérilisation variable. Cette résistance est caractérisée par la valeur de D “temps nécessaire dans des conditions définies pour réduire d’un facteur 10 (1 log) la population des micro-organismes présents”. Les spores de bactéries comme celles des Bacillus ont généralement une valeur de D élevée (supérieure à 1 min) alors qu’elle est faible voir très faible pour les formes non sporulantes. La valeur de D à la chaleur humide d’un micro-organisme peut être évalué à l’aide d’un équipement de type BIER VESSEL. La connaissance qualitative de la biocharge permet donc aussi d’évaluer le risque avant stérilisation.