Validation des procédés de nettoyage : pourquoi et comment valider les méthodes analytiques et de prélèvements associées.

L’annexe 15 des BPF exige que l’ensemble des méthodes utilisées dans le cadre des qualifications et validations soient validées avec des limites de quantification appropriées (point 9.1.).
Le but de cet article est de proposer une méthodologie de validation de méthodes analytiques et de prélèvements physico- chimiques appliquée à la validation des procédés du nettoyage : l’objectif de chaque test sera expliqué ainsi que la méthodologie à mettre en œuvre pour le réaliser.
Procédés de nettoyage : illustration

1. Prérequis à la validation des méthodes

Avant de réaliser les validations des méthodes, les éléments suivants doivent être connus : • Le traceur

• Son critère d’acceptation
• La taille et la nature des surfaces à prélever
• Les méthodologies de prélèvements utilisées (écouvillonnage, rinçage, nature des solvants de prélèvement et dilution, schémas…)

Le traceur sera défini au préalable en fonction de la stratégie appliquée dans le projet de validation du nettoyage. Le type de méthode analytique utilisée (spécifique ou non spécifique), sera choisi en fonction des caractéristiques chimiques du traceur, des seuils de quantification à atteindre, des moyens à disposition dans le laboratoire, des données historiques existantes…

Il est conseillé de dissocier la validation de la méthode analytique de la validation des méthodes de prélèvement pour diminuer les risques de résultats erronés. En effet, en cas de validation simultanée des deux méthodes, si un biais est présent sur la méthode analytique, il peut être occulté par un biais présent sur la méthode de prélèvement, et inversement.

Par exemple, si une méthode analytique surdose (problématique de calibration d’équipement par ex.), les taux de recouvrement risquent d’être surévalués. Par la suite, si la méthode est transférée ou si la calibration est corrigée, l’application du taux de recouvrement surévalué risque de fournir un résultat conforme alors qu’il ne l’est pas.

 

2. Validation de la méthode analytique

 

2.1 Les techniques analytiques les plus couramment rencontrées sont classées selon leur type, dans le tableau ci-dessous :

Procédés de nettoyage : tableau 1

Par définition, la spécificité est l’unique test qui ne peut pas être réalisé pour les méthodes non spécifiques puisqu’il consiste à vérifier que le signal fourni par l’appareil est bien issu du traceur seul et qu’il n’est pas pollué par de potentielles interférences.

Il est réalisé en analysant individuellement des solutions constituées des potentielles sources de pollution afin de visualiser leur signal et vérifier que ce dernier n’interfère pas avec celle du traceur.

Généralement, on vérifiera l’absence d’interférence apportée par : Les différents matériaux à prélever ;

• Le matériel de prélèvement
• Les solvants de prélèvement et de dilution, s’ils sont différents • Les agents de nettoyage (détergent, désinfectant)
• Les composés présents dans le produit autres que le traceur.

Le risque de ne pas vérifier l’absence d’interférence est d’avoir de fausses non-conformités lors des prélèvements sur les équipements de production.

En effet, le signal mesuré et attribué en totalité au traceur peut éventuellement être l’accumulation de plusieurs autres interférences, avec pour effet de surdoser la quantité réelle de traceur.

Le critère d’acceptation du test doit être défini en fonction du niveau de risque acceptable. Il peut être, par exemple :

• absence d’interférence,
• quantité d’interférences inférieure à la limite de détection de la méthode,
• quantité d’interférences inférieure à un pourcentage de la valeur du critère d’acceptation de la validation du nettoyage (0,5% du critère par exemple).

 

2.2 La limite de quantification

L’objectif est de déterminer la quantité à partir de laquelle le détecteur visualise la présence du traceur, et peut la quantifier avec fidélité et exactitude. Elle permet de s’assurer que l’appareil analytique possède une sensibilité suffisante pour quantifier les échantillons dans le cadre de l’exercice de validation du nettoyage. La limite de quantification (LOQ ou LQ) doit impérativement être inférieure au critère d’acceptation fixé pour la validation du nettoyage, tout en tenant compte de l’impact de l’incertitude de la mesure et des taux de recouvrement associés aux prélèvements (voir §3).

La LOQ peut, dans un premier temps, être estimée. Il existe plusieurs méthodes pour ce faire :

• L’approche selon le rapport signal / bruit couramment utilisée en chromatographie
La limite de quantification est généralement atteinte quand le rapport signal/bruit est égal ou supérieur à 10

• La méthode expérimentale consistant à analyser plusieurs flacons de solutions du traceur à des concentrations croissantes jusqu’à atteindre les critères fixés à partir desquels on considérera que la réponse est exacte et fidèle
• Evaluation via l’écart type obtenu sur plusieurs injections de blancs
• Evaluation via l’écart type de l’ordonnée à l’origine d’une droite obtenue en analysant des solutions de concentrations croissantesPour les deux techniques utilisant les écart-types, la formule permettant l’obtention de la limite de quantification estimée est la suivante :

Procédés de nettoyage : formule 1

Une fois la limite de quantification estimée, cette dernière doit être validée, en analysant au moins 6 solutions préparées au niveau de la limite de quantification estimée, et en vérifiant que : Le coefficient de variation (CV) sur les résultats obtenus est inférieur à un seuil prédéfini.

Il permet de juger de la disparité des résultats obtenus et s’obtient par le calcul suivant :

Procédés de nettoyage - formule 2

L’exactitude de chaque valeur mesurée est comprise dans un intervalle prédéfini. Elle se calcule ainsi :

Procédés de nettoyage : formule 3

Il reviendra à chacun de fixer les normes qu’il souhaite en fonction du degré de fiabilité qu’il exige sur le résultat fourni.

 

2.3 La linéarité

Il s’agit de vérifier que, sur une plage de concentrations donnée, la méthode d’analyse permet d’obtenir des résultats directement proportionnels avec la concentration du traceur, et qu’il n’y a pas d’effet de saturation du détecteur.

Pour réaliser ce test, il faut analyser un minimum de 5 solutions de concentrations différentes en traceur. Les différents niveaux de concentrations peuvent être préparés à partir de différentes solutions mères afin de s’assurer de l’exactitude de l’équation obtenue. Une droite de régression linéaire est établie en représentant le signal obtenu lors de l’analyse en fonction de la concentration connue injectée. Le coefficient de corrélation (r²) de cette droite doit être proche de 1 afin que la réponse soit jugée proportionnelle à la quantité de traceur. Un critère d’acceptabilité r² ≥ 0,99 est généralement utilisé.

La gamme validée peut s’étendre de la limite de quantification jusqu’à l’équivalent de 120% à 150% du critère d’acceptation de la validation du nettoyage. Dans tous les cas, le critère d’acceptation de la validation du nettoyage doit impérativement se situer entre la valeur de la LOQ et le dernier point de gamme validée (figure 1).

Procédés de nettoyage : figure 1

Tout résultat obtenu inférieur à la LOQ ou supérieur au dernier point de gamme lors des analyses de validation du nettoyage, ne pourra être rendu chiffré.

 

2.4 La fidélité

Le but est de vérifier que la méthode fournit toujours les mêmes résultats lorsqu’une même quantité de traceur est analysée.

Il s’agit d’injecter plusieurs fois une unique solution de traceur à concentration connue et de réaliser une analyse statistique sur les résultats obtenus.

Ce test est réalisé à différents niveaux :

La répétabilité : une série d’échantillons est préparée et analysée sur un court laps de temps (même journée, même opérateur, même équipement)

La fidélité intermédiaire : deux séries supplémentaires identiques à celle de la répétabilité sont analysées avec une variation imposée pour chacune des séries : changement d’opérateur, de jour, ou d’analyseur

La reproductibilité : les 3 paramètres (opérateur, jour, analyseur) doivent varier, il s’agit d’essais inter-laboratoires.

L’ICH.Q2(R1) impose de valider la fidélité selon l’une des deux méthodologies suivantes :

6 injections à une concentration cible (souvent le critère d’acceptation de la validation du nettoyage)

3 injections de 3 concentrations (9 injections au total). On choisira un niveau de concentration bas (entre la limite de quantification et le critère d’acceptation de validation du nettoyage), un niveau intermédiaire (correspondant généralement au critère d’acceptation), et un niveau haut (entre le critère d’acceptation et le dernier point de gamme) de manière à vérifier la fidélité de la méthode sur l’ensemble de la gamme de concentrations.

Afin d’évaluer la fidélité de la méthode, le coefficient de variation (CV) est calculé au sein de chaque série d’injection (CV intra-série), ainsi que pour l’ensemble des séries (inter-séries). La fidélité est validée si chacun des CV obtenu est inférieur au critère prédéfini (souvent 5% ou 10% selon la méthode analytique utilisée et l’exigence).

 

2.5 L’exactitude

Ce test permet de vérifier que la méthode fournit les résultats exacts. Il est réalisé en analysant des solutions préparées en triple à 3 concentrations différentes (9 solutions en tout). Les concentrations choisies peuvent être identiques à celles sélectionnées pour l’évaluation de la fidélité (voir § 2.4).

Pour chaque échantillon on calcule alors le pourcentage d’exactitude correspondant au ratio obtenu entre la valeur mesurée et la valeur théorique de concentration de la solution injectée.

L’intervalle 90% – 110% est couramment utilisé comme critère d’acceptabilité des résultats, mais il reviendra à chacun de fixer les normes qu’il souhaite en fonction du degré de fiabilité qu’il exige sur le résultat fourni. Si la concentration de travail est très faible, il pourra être nécessaire d’élargir la plage d’acceptation des résultats.

Remarque : Il faut différencier l’exactitude de la fidélité. Une méthode peut être fidèle et inexacte ou exacte et non fidèle (figure 2).

Procédés de nettoyage : figure 2

 

2.6 La robustesse

La robustesse permet de s’assurer de la fidélité et de l’exactitude de la méthode analytique même en cas de variations légères sur les paramètres de celle-ci.

L’ICH.Q2(R1) explique que la robustesse peut être considérée comme induite dans le développement et la validation de la méthode analytique. En effet, la validation se déroulant sur plusieurs jours, voire semaines, des variations de conditions apparaissent nécessairement pendant la réalisation des tests.

Cependant, il est également possible de réaliser un test supplémentaire en introduisant volontairement une légère variation et en mesurant l’impact de celle-ci.

Les paramètres qui peuvent être modifiés sont par exemple :

• La composition de la phase mobile,

• La température du four de la colonne chromatographique,

• La longueur d’onde de détection,

• La modification du débit,

• Le changement de lots de consommables…

Après apport volontaire de la variation choisie, une série d’injections à concentration connue est réalisée afin de vérifier que la fidélité et l’exactitude de la série restent conformes.

 

3. Validation des méthodes de prélèvement

 

L’objectif de la validation des méthodes de prélèvement est de déterminer le pourcentage de traceur présent initialement sur l’équipement qui sera réellement récupéré. Elle permet aussi de vérifier les conditions et la durée de stabilité des échantillons (voir §3.6).

Le pourcentage ainsi déterminé, appelé « taux de recouvrement » permet de corriger le résultat analytique pour obtenir la « valeur vraie » des prélèvements réalisés sur les équipements, et ainsi obtenir la réelle contamination de la surface prélevée.

Le taux de recouvrement est la composante du taux de récupération (capacité de récupération du résidu sur la surface) et du taux d’extraction. (Figure 3)

Procédés de nettoyage : figure 3

Une méthode de prélèvement est validée et un taux de recouvrement est déterminé pour :

• Un traceur donné

• Un matériau défini (Inox, polymères, etc.)

• Une dimension de surface de prélèvement maximale

• Une référence de matériel de prélèvements (écouvillons…)

• Une méthodologie de prélèvement

• Un solvant de prélèvement

• Un solvant de dilution et son volume

• Une méthode d’extraction

Si une variation intervient sur un paramètre cité précédemment, le taux de recouvrement ne peut plus être appliqué car l’efficacité du prélèvement peut avoir varié.

Deux types de méthodes de prélèvements existent : les prélèvements directs et indirects. Le prélèvement direct nécessite l’intervention d’opérateur exerçant une action mécanique sur la zone à prélever et donc une habilitation. Le prélèvement indirect correspond à des prélèvements via rinçage ou trempage, il est possible de l’automatiser.

 

3.1 Les prélèvements indirects

Les étapes d’un prélèvement indirect sont les suivantes :

1) Ajout du solvant de prélèvement

2) Récupération du solvant après un temps fixe et déterminé au préalable

3) Analyse de la solution contenue dans le flacon

Afin de valider les taux de recouvrement au laboratoire il est possible d’envisager la méthodologie suivante : dépôt d’une quantité connue de traceur sur un coupon de matériau représentatif de l’équipement. Puis, ruissellement d’une quantité fixe de solvant de prélèvement pour récupération puis analyse (Figure 4).

 

Procédés de nettoyage : figure 4

 

3.2 Les prélèvements directs

Les étapes d’un prélèvement direct sont les suivantes :

1) Mise en œuvre du schéma de prélèvement défini à l’aide de l’écouvillon

2) Introduction de l’écouvillon dans un flacon

3) Ajout du solvant de dilution

4) Application de la méthode d’extraction

5) Analyse de la solution contenue dans le flacon

Afin de valider les taux de recouvrement au laboratoire il est possible d’envisager la méthodologie suivante : dépôt d’une quantité connue de traceur sur un coupon de matériau représentatif de l’équipement. Réalisation du prélèvement selon la méthodologie définie puis analyse (Figure 5).

Procédés de nettoyage : figure 5

 

3.3 Le taux d’extraction

Le taux d’extraction ne peut être déterminé que sur les prélèvements directs et ne concerne pas les prélèvements indirects.

Sa détermination permet de mesurer l’efficacité de l’étape d’extraction (étape 4 du §3.2) en évaluant quel pourcentage de traceur présent sur l’écouvillon après prélèvement parvient à passer en solution grâce à la méthode d’extraction.

La méthodologie pour sa détermination est la suivante :

• Dépôt d’une quantité connue de traceur directement sur l’écouvillon

• Extraction de l’écouvillon selon la méthodologie définie

• Analyse de la solution obtenue

Le dépôt de la solution directement sur l’écouvillon permet de mimer un écouvillonnage efficace à 100%. Ainsi seule l’étape d’extraction est

évaluée.

Idéalement le taux d’extraction sera étudié à trois concentrations (valeur inférieure au critère d’acceptation (CA), au niveau du CA et supérieure au CA) afin de s’assurer que la même proportion de traceur passe en solution, quel que soit la quantité de celui-ci.

Le taux d’extraction n’est pas utilisé pour l’interprétation des résultats de validation du nettoyage. Il permet cependant d’assurer une optimisation de la méthode de prélèvement. Même s’il peut être étudié uniquement dans le cas où les taux de recouvrement obtenus sont trop faibles, il est conseillé de le réaliser en amont afin de garantir une efficacité à chaque étape du prélèvement.

La formule de calcul est la suivante :Procédés de nettoyage : formule 4

Des taux d’extraction supérieurs à 70% sont généralement jugés comme acceptables. S’ils sont inférieurs à 70% la méthode d’extraction nécessite une optimisation (méthodologie, temps…). Le critère dépend de nouveau de l’exigence souhaitée.

 

3.4 Le taux de recouvrement

Le taux de recouvrement permet de mesurer l’efficacité de la méthode de prélèvements dans son ensemble. Il a pour objectif de quantifier quel pourcentage de traceur présent sur la surface prélevée se trouvera réellement dans la solution finale pour analyse.

Sa détermination doit être réalisée pour chaque type de prélèvement selon la méthodologie suivante :

• Dépôt d’une quantité connue de traceur sur des coupons de matériaux représentatif de l’équipement

• Prélèvements selon la méthodologie définie

• Analyse des prélèvements

Idéalement, l’étude des taux de recouvrement sera réalisée en triple, à 3 niveaux de concentrations : un compris entre la LOQ et le critère d’acceptation, un au niveau du critère d’acceptation, et un supérieur au critère d’acceptation. Le but étant de couvrir l’ensemble des cas rencontrés lors des prélèvements.

Pour les prélèvements directs, le test doit être réalisé à minima par deux opérateurs différents, afin de tenir compte de la variabilité opérateur. Pour les prélèvements indirects, le facteur opérateur n’intervenant pas, il n’est pas nécessaire d’en faire intervenir plusieurs.

La formule de calcul est la suivante :

Procédés de nettoyage : formule 5

Des taux de recouvrement supérieurs à 70%, avec un coefficient de variation sur l’ensemble des valeurs obtenues inférieur ou égal à 10% sont généralement considérés comme acceptables.

L’échelle suivante peut être appliquée :

Procédés de nettoyage

Une fois les valeurs de taux de recouvrement générées, et conformes aux spécifications fixées, elles servent à :

• Définir la valeur qui sera utilisée comme facteur de correction dans les calculs permettant l’interprétation des analyses de validation du nettoyage

• Définir la valeur qui sera utilisée comme critère à atteindre dans le cadre de l’habilitation des préleveurs

Afin de prendre en compte l’efficacité de la méthode de prélèvement ainsi que la variabilité de celle-ci, il est préférable de réaliser une étude statistique des données obtenues.

Le graphique ci-dessous représente des valeurs obtenues lors de la validation d’une méthode de prélèvements directs. Il représente l’ensemble des taux de recouvrement déterminés pour les 18 prélèvements réalisés. La ligne horizontale rouge représente la moyenne des valeurs, les grises représentent l’intervalle “moyenne ± 2 écart-types” et les bleues représentent l’intervalle “moyenne ± 3 écart-types”. (Figure7)

Procédés de nettoyage : figure 7

Statistiquement, il est établi que 95% des valeurs générées selon le modèle se trouvent dans l’intervalle gris, ainsi que 99% des valeurs générées se trouvent dans l’intervalle bleu.

Les intervalles ainsi générés prennent en compte les valeurs obtenus via la moyenne, mais également la disparité des résultats par l’application des écart-types.

C’est pourquoi il est intéressant de sélectionner la borne inférieure pour l’interprétation des résultats de prélèvements de validation du nettoyage (moyenne – 3 écart-types). Ainsi, l’efficacité réelle du prélèvement à 99% de chances d’être couverte par ce taux de recouvrement appliqué. Dans notre exemple, le taux choisi pour correction des résultats serait de 68%.

Pour les habilitations (voir §3.5), la sélection de la borne intermédiaire (moyenne – 2 écart-types) permet d’appliquer un critère un peu plus sévère. En effet, le risque en appliquant le même taux de recouvrement pour les habilitations et les analyses de validation du nettoyage, est de corriger le résultat par un taux non représentatif de l’efficacité réelle du prélèvement réalisé. Si l’opérateur parvient tout juste à atteindre le taux de recouvrement servant de référence lors de l’habilitation, il n’y a aucune garantie qu’il arrive à reproduire cette efficacité lors d’autres prélèvements. La sélection d’un critère différent permet de garder une marge de sécurité.

 

3.5 La formation et l’habilitation aux prélèvements

Une fois les méthodes de prélèvement validées, il est nécessaire de former et d’habiliter les opérateurs en charge des prélèvements sur les équipements.

L’habilitation se déroule en plusieurs étapes :

• Pris de connaissance des instructions de méthodologies de prélèvements

• Informations sur la criticité des prélèvements (précautions particulières dans le cas d’une analyse au COT-mètre par exemple)

• Réalisation de prélèvements dans le cas de prélèvements directs

Chacune des étapes doit être formalisée et tracée afin de pouvoir justifier de la formation/habilitation des différents opérateurs.

Seuls les prélèvements directs nécessitent la réalisation d’essais d’habilitation. En effet, seul ce type de prélèvement nécessite une intervention humaine dont le geste aura un fort impact sur l’efficacité du prélèvement.

Toute personne ayant participé à la validation de la méthode des prélèvements est automatiquement habilitée. Pour les autres, la réalisation de prélèvements au laboratoire, à une concentration équivalente au critère d’acceptation doit être répétée au minimum 3 fois.

Un opérateur est considéré habilité quand chacun de ses prélèvements est supérieur ou égal aux taux de recouvrement visé et si le CV calculé sur ses trois essais est inférieur ou égal à 10%.

Dans le cas où une même technique de prélèvement est utilisée pour différents traceur, il peut être justifié de ne pas former et habiliter les opérateurs pour chacun des traceurs.

Il est également conseillé d’assurer un suivi des habilitations des préleveurs en mettant en place une fréquence de réhabilitation.

 

3.6 La stabilité des échantillons

Il s’agit de déterminer pendant combien de temps et dans quelles conditions un échantillon peut être conservé entre le prélèvement et l’analyse en laboratoire sans observer de dégradation significative de l’échantillon. (Figure8)

Procédés de nettoyage : figure 8

La validation de la stabilité permet d’éviter des faux-négatifs en vérifiant que l’absence de traceur lors de l’analyse n’est pas simplement due à une détérioration de ce dernier entre le prélèvement et l’analyse de l’échantillon.

Ce test permet également d’avoir de la flexibilité dans le planning d’analyse. Cela peut permettre d’analyser sur une même séquence des échantillons prélevés à des temps différents, de relancer une séquence d’analyse suite à un problème technique, ou bien d’envoyer des échantillons pour analyse dans un autre laboratoire.

La stabilité peut être étudiée sur différents types d’échantillons :

• Traceur en solution (pour mimer un prélèvement indirect)

• Traceur déposé sur un écouvillon et mis en solution

• Traceur déposé sur un écouvillon, stocké sec, et mis en solution juste avant analyse

Les conditions testées doivent être celles auxquelles les échantillons peuvent être confrontés. Il faut donc, par exemple, prendre en compte les conditions de transport des échantillons (durée, température, …). Pour la température, il peut s’avérer plus simple de valider la stabilité avec un stockage à froid, la température à froid étant plus facile à maitriser en transport que la température ambiante (variable selon les conditions de transport).

Pour réaliser ce test, des échantillons de traceur sont préparés à une concentration connue (généralement au niveau du critère d’acceptation) et sont stockés dans les conditions définies (correspondant aux conditions de routine).

Une analyse des échantillons ainsi préparés à J0 (jour initial de l’étude) permet d’obtenir des résultats qui seront utilisés comme référence pour l’évaluation de la stabilité. Puis les échantillons, tous préparés à J0, seront injectés à fréquence définie afin d’évaluer la potentielle variation de concentration.

Afin de juger de la stabilité des échantillons, les résultats obtenus à chaque série d’injections seront comparés à ceux obtenus lors du J0 grâce à la formule suivante :

Procédés de nettoyage : formule 6

Les critères pour juger de la stabilité peuvent être les mêmes que ceux du test d’exactitude par exemple. La détermination de ces derniers dépend de la tolérance que l’on souhaite s’accorder sur les résultats.

 

Conclusion

La validation de la méthode analytique permet de vérifier qu’elle mesure de manière exacte et répétable, le traceur recherché, dans la gamme de concentrations d’étude. Sans cette étape, les résultats obtenus peuvent être remis en cause.

La validation des méthodes de prélèvements permet de déterminer quelle proportion de traceur présent sur l’équipement est récupérée lors les prélèvements. Le pourcentage ainsi déterminé permet de calculer la quantité réelle de traceur qui était présente sur la surface prélevée.

Ces validations sont des prérequis à toute analyse réalisée dans le cadre de la validation des procédés de nettoyage pour assurer la fiabilité des résultats obtenus et ainsi maitriser les risques de contaminations.

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Procédés de nettoyage : Eva Bellanger

Eva BELLANGER – Cophaclean

Titulaire d’un master, Eva est spécialiste en analyses chimiques à l’état de traces depuis 7 ans. Elle est chargée de projet analytique chez Cophaclean, société spécialisée en consulting en industries de Santé. Elle intervient pour la réalisation des projets analytiques, formations ou en tant que support technique.

eva.bellanger@cophaclean.fr

Procédés de nettoyage : Laurent Simon

Laurent SIMON – Cophaclean

De formation en chimie analytique également, Laurent possède une expérience de 18 années dans le domaine pharmaceutique en validation du nettoyage et en développement analytique.

Il est chef de projet chez Cophaclean et assure le management de projet en qualification/validation. Il réalise également des missions d’expertise/audits ainsi que des formations.

laurent.simon@cophaclean.fr

Glossaire

CA : Critère d’Acceptation
COT : Carbone Organique Total
CV : Coefficient de Variation
LOQ / LQ : Limite de quantification / Limit of quantification

Références

1. ICH.Q2(R1) Validation of Analytical Procedures : Text and Methodology
2. BPF Annexe 15 Qualification et Validation
3. PDA Technical Report n°29 et 49