1. Contexte et définitions

Sources de variabilité

L’objectif de la “replicate strategy” est de diminuer l’impact des sources de variabilité d’une méthode analytique. Chaque méthode présente des sources de variabilité différentes, et l’étude approfondie de cette variabilité (pendant le développement et la validation de la méthode) est nécessaire pour adopter une stratégie de répétitions de tests efficace. Les 4 grandes sources de variabilité sont résumées dans le tableau1. Il est impossible de maîtriser l’ensemble des sources de variabilité. Mais il convient de comprendre et dompter les différentes sources issues d’étapes du process analytique lui-même. En fin de développement, la validation d’une méthode analytique permettra de mesurer la variabilité résiduelle qui impactera la fiabilité des mesures obtenues avec cette méthode.

Lors de la validation de méthode, l’étude de la Précision (Fidélité) permet d’étudier la dispersion des données (calcul de variances, d’écarts type et de Coefficients de Variation (CV), et d’évaluer :

• Un CV de répétabilité : proportionnel à l’épaisseur des niveaux 1+2 du tableau précédent ;
• Un CV de précision intermédiaire : proportionnel à l’épaisseur des niveaux 1+2+3.

Le niveau 1 est contrôlé régulièrement (qualification périodique d’équipement et Tests de conformité du système à chaque série d’analyse). Il peut toutefois varier d’un jour à l’autre, et cela se répercute sur le calcul du CV de précision intermédiaire.
Le niveau 2 est représentatif de la préparation d’échantillons. C’est la variabilité observée sur plusieurs déterminations à partir d’un même échantillon homogène. Cela consiste à répéter plusieurs fois le paragraphe “préparation d’échantillons” de la procédure analytique.

Plus cette préparation est complexe, plus ce niveau sera susceptible d’être une source de variabilité importante. La qualité de la description de préparation d’échantillons, comme les précisions apportées sur les modes de préparation, les durées d’agitation, l’aspect attendu des échantillons après chaque étape du traitement, sont autant d’éléments qui permettront d’éviter une variabilité différente d’un analyste à l’autre.

Le niveau 3 correspond à la variabilité observée entre les moyennes des différentes séries d’analyse sur un même lot homogène. Cela correspond à répéter plusieurs fois la procédure analytique dans son ensemble : préparation des réactifs, des diluants, des solutions de référence, etc… Plusieurs analystes et plusieurs équipements peuvent être impliqués durant les séries effectuées sur plusieurs jours durant la validation de la méthode.

Ainsi, la variabilité entre les séries correspond à la variabilité inhérente aux pesées et préparations des solutions de calibration, à laquelle peut s’ajouter un effet équipement, un effet analyste, ou un effet de modification des conditions climatiques d’un jour à l’autre (température, humidité, ensoleillement). La préparation d’une solution de référence n’est généralement pas complexe, mais la plus grande attention doit y être attachée afin de limiter de telles variations inter-séries, qui sont fortement dommageables pour la qualité des résultats obtenus avec la méthode.

Le niveau 4 correspond à une potentielle variabilité entre plusieurs laboratoires, qui n’est généralement pas estimée en validation. Une telle variabilité existe, du fait d’habitudes de travail différentes d’un laboratoire à l’autre (procédures, formations, culture, etc…) et, parfois, d’environnement de travail différent (température, humidité, lumière, etc.). On analyse cette variabilité durant les étapes de transfert analytique qui jalonnent le cycle de vie des procédures analytiques.

Dans le cadre de la définition d’une “Replicate Strategy”, nous nous attarderons sur l’impact potentiel des épaisseurs des 2ème et 3ème niveau ou, de façon plus pratique et pragmatique, sur l’analyse des CV de répétabilité et de précision intermédiaire calculés durant la validation.

Intérêt d’une “Replicate Strategy”

En routine au laboratoire, chaque mesure individuelle sera soumise à l’ensemble des sources de variabilités et pourra varier avec un CV proche du CV de précision intermédiaire défini en validation.

Remarque : Il est bon de savoir qu’environ 95% des valeurs individuelles se situeront entre -2xCV et + 2xCV (avec l’hypothèse d’une distribution Normale des données, ce qui est le plus souvent le cas lors des dosages réalisés dans l’industrie pharmaceutique). Il est donc primordial de comprendre, maîtriser et diminuer la variabilité autant que possible durant le développement de la méthode analytique.

L’objectif d’une “Replicate Strategy” est de définir le nombre de séries de mesure et de mesures par série pour définir un résultat moyen, qui sera le résultat rapporté dans un rapport d’analyse et comparés aux spécifications du produit. Ne plus comparer chaque mesure individuelle permet de diminuer grandement la gestion de résultats OOS.
=> Répéter plusieurs analyses dans une même série permet de réduire l’impact du 2ème niveau, alors que faire plusieurs séries permet de réduire l’impact du 3ème niveau.

Quelques définitions et quelques calculs

Ecart type et Coefficient de Variation (CV)
Lors de la validation de méthode, on exploite les résultats de précision à travers une analyse de Variance (ANOVA). Cette analyse de variance permet de décomposer la variance totale observée lors de n séries de p répétitions en :

• une variance de répétabilité S²_w (w pour within group) et S_w l’écart type de répétabilité,
• une variance inter-séries S²_b (b pour between groups) et S_b l’écart type inter-séries,
• une variance de précision intermédiaire S²_IP = S²_w+ S²_b et S_IP l’écart type de précision intermédiaire.

Pour chacun des écart-types calculés, on peut définir le CV, qui est la variance rapportée à la moyenne, exprimé en pourcentage de la moyenne. Afin de simplifier les propos pour illustrer l’intérêt d’une “Replicate Strategy”, nous prendrons la moyenne = 100, ce qui permet d’avoir CV = écart type/moyenne x 100 = écart type.

Le CV de répétabilité est donc alors égal à l’écart type de répétabilité S_w, et est proportionnel aux épaisseurs des niveaux 1+2, alors que le CV de précision intermédiaire est alors égal à l’écart type de précision intermédiaire S_IP et est proportionnel aux niveaux 1+2+3.

Ecart type d’une moyenne
L’écart type d’une moyenne de n résultats est réduit d’un facteur √n par rapport à l’écart type initial (ou la variance est réduite d’un facteur n). Dans le cas qui nous intéresse, si lors du dosage on effectue p séries, avec n répétitions par série, la variance de répétabilité sera réduite d’un facteur n x p et la variance de précision intermédiaire sera réduite d’un facteur p. Les répétitions ont donc pour effet de “réduire” l’épaisseur des niveaux évalués durant la validation.
=> Moyenner plusieurs mesures réduit donc l’incertitude associée au résultat moyen ainsi calculé.

Incertitude de mesure
Ici encore, l’objectif est de comprendre le concept d’incertitude, et non pas d’en donner toutes les définitions existant dans la littérature. Je remercie donc les lecteurs de ne pas me blâmer pour la potentielle incertitude de mes propos sur l’incertitude…
L’incertitude d’une mesure est directement liée à la variabilité de la méthode servant à la générer. Chaque mesure n’est en effet qu’une estimation de la valeur “vraie”, plus ou moins proche de cette valeur vraie.

D’un point de vue mathématique, elle est sous une forme U=k.√variance, avec k un facteur de couverture, constante statistique associée à une probabilité (pour une distribution Normale et une probabilité de 95%, k=2 est fréquemment utilisé : cela rejoint la remarque édictée précédemment).

Avec les résultats de la validation, la variance est décomposée en variance intra-run et inter-run. Ainsi, l’incertitude associée est U=k.√(S² _w + S²_b).

Pour un résultat provenant de la moyenne de p séries, avec n répétitions par série, on peut définir l’incertitude de ce résultat moyen (U’) avec la formule suivante, décrite par Schofield et al.^[2]

Ainsi, l’incertitude diminue quand on augmente n et/ou p.
La connaissance de l’importance relative des 2^ème et 3^ème niveaux des sources de variabilité permet justement de définir, s’il vaut mieux augmenter n, p, voire les 2 pour obtenir un résultat moyen qui ait une incertitude inférieure au niveau qu’on peut tolérer.

2. Analyse de différents scénarii

L’utilisation de la formule d’incertitude du résultat moyen U’ est simulée dans différents scénarii résumés dans le tableau 2. Rappel : pour le calcul du CV des différents scénarii, la valeur moyenne est prise à 100%.

Explication des différents scenarii

Pour les scénarii 1 à 3
Le CVIP est identique (correspondant à l’épaisseur des niveaux 1, 2 et 3), mais la variabilité est répartie différemment entre l’intra-série (niveau 1+2) et l’inter-série (niveau 3):
Pour le scénario 1
L’épaisseur du 3^ème niveau est faible par rapport au 2ème.
Pour le scénario 2
La variabilité est également répartie entre intra et inter séries. Cela correspond à l’exemple fourni dans le stimuli de l’USP^[2].
Pour le scénario 3
L’épaisseur du 3^ème niveau est importante par rapport au 2^ème . Pour le scénario 4
Le CVIP est porté à 2% avec une variabilité répartie entre intra et inter-série, afin d’illustrer l’impact important d’une augmentation de la variabilité générale sur l’incertitude globale.

Analyse des différents scenarii

Pour ces différents scénarii, l’impact des variations de p (1, 2 ou 3 séries distinctes) et de n (1 à 6 répétitions par série) est représenté graphiquement avec une courbe par valeur de p et le nombre de répétitions par série, n, sur l’axe des X:
A la lecture de ces courbes, il est facile de définir la procédure analytique en termes de nombre de séries et de répétitions par séries pour définir un résultat moyen ayant une incertitude réduite en deçà d’une limite qu’on aura fixée en amont.

	Scenario 1 (CVr=0,95%, CVip=1,0%) Dans ce Scenario 1, on voit qu’augmenter n ou p a un effet sur l’incertitude du résultat moyen. Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 1,5%, il suffira de définir une stratégie avec n=2 répétitions au sein d’une même série d’analyse (p=1, n=2). Cela sera plus facile à organiser au laboratoire que l’alternative de 2 séries distinctes avec une seule détermination par série(p=2, n=1). Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 2,0%, une seule détermination sur une série unique suffira (p=1, n=1).
	Scenario 2 (CVr=0,71%, CVip=1,0%) Dans ce Scenario 2, on voit qu’augmenter p a plus d’effet sur l’incertitude du résultat moyen que d’augmenter n. Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 1,5%, il sera nécessaire d’organiser au laboratoire 2 séries distinctes avec au moins une détermination par série (p=2, n=1). Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 2,0%, une seule détermination sur une série unique suffira (p=1, n=1).
	Scenario 3 (CVr=0,32%, CVip=1,0%) Dans ce Scenario 3, on voit qu’augmenter n n’a quasiment aucun effet sur l’incertitude du résultat moyen, car la variabilité est essentiellement inter-série. Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 1,5%, il sera nécessaire d’organiser au laboratoire 2 séries distinctes avec une détermination par série (p=2, n=1). Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 2,0%, une seule détermination sur une série unique suffira (p=1, n=1).
	Scenario 4 (CVr=1,41%, CVip=2,0%) Dans ce Scenario 4, la variabilité de l’analyse est telle qu’aucune “Replicate Strategy” raisonnable en termes d’activité de laboratoire de Contrôle Qualité ne permettrait d’assurer une incertitude du résultat moyen inférieure ou égale à 1,5%.

Si l’incertitude maximale du résultat moyen est fixée à 2,0%, il faudra prévoir 3 séries avec au moins 2 répétitions par série (p=3, n=2)
Il convient à chacun de définir clairement l’incertitude maximale qu’il pourra tolérer pour le résultat qu’il souhaite obtenir pour définir la “Replicate Strategy” adaptée à sa méthode. Cette incertitude dépendra des spécifications du produit, en lien avec l’index thérapeutique du composé testé. Dans un article^[3], Barnett et al. proposent de fixer l’incertitude maximale à 60% de la “marge de manœuvre” des spécifications.
Pour une spécification fixée entre 95.0 et 105.0%, la marge de manœuvre autour de la valeur cible est de ±5.0%. L’incertitude maximale du résultat moyen pourrait alors être fixée à 3.0% dans ce cas de figure. Ce type de calcul et les illustrations associées sont des outils précieux pour définir dans la procédure analytique le résultat qui sera rapporté pour être comparé aux spécifications.

3. Conclusion

La “Replicate Strategy” décrite dans le chapitre <1220> draft édité dans Pharmacopeial Forum[1] est un outil permettant de fiabiliser les résultats générés au laboratoire et diminuer le risque d’occurrence de résultats hors spécifications qui seraient dus à la variabilité intrinsèque de la méthode. Une telle stratégie est définie méthode par méthode.

La stratégie définie doit être clairement décrite dans la méthode qui a été approuvée. Elle fait donc partie intégrante de la procédure analytique permettant de contrôler le produit au laboratoire.

Comme décrit dans le guide FDA sur les OOS [4], la “Replicate Strategy”, qui permet de ne comparer que le résultat moyen aux spécifications du produit, nécessite d’associer un critère sur la variabilité des résultats individuels en plus du critère sur la valeur moyenne obtenue. Seul le respect conjoint des 2 critères permet de conclure à la conformité de l’échantillon testé.

Le second critère sur la variabilité peut être basé sur un écart maximal acceptable (EMA) entre les valeurs individuelles, sur le CV calculé sur les valeurs individuelles, ou encore sur le calcul d’un intervalle de confiance. Les différentes façons de fixer un tel critère feront certainement partie des futurs débats sur la gestion pragmatique et pratique des procédures analytiques tout au long du cycle de vie du produit. En tout cas, cela fera partie des débats du GIC A3P sur le cycle de vie des méthodes analytiques, constitué en octobre 2020, qui vous tiendra au courant des résultats de ses réflexions.