Par ailleurs, ce procédé par voie chimique est fonction de la concentration d’H₂0₂ vaporisé présent dans l’ambiance de la chambre, puis condensé à la surface de la charge. L’humidité relative en début de cycle, la température, l’efficacité du brassage et l’homogénéité de distribution du fluide décontaminant sont des paramètres qui influencent un cycle de bio-décontamination répétable et valide. La bio-décontamination peut se découper en plusieurs phases à savoir un test d’étanchéité, un conditionnement, une injection, une stabilisation et une phase d’aération qui réduit la concentration d’H₂0₂ jusqu’à un niveau compatible avec les activités se déroulant dans l’isolateur. Cette concentration résiduelle en H₂0₂ affecte potentiellement les molécules actives des produits pharmaceutiques. Par conséquent, les autorités, comme pour les VLEP recommandent des limites d’exposition pondérées dans le temps entre 0.5 et 1.0 ppm.

Pour rappel, les User RequirementSpécifications (URS) concernant les isolateurs pour tests de stérilité necessitant une bio-décontamination au H₂0₂ n’intégraient auparavant aucune demande particulière sur le temps de rinçage, pas même la mesure du taux résiduel d’agent stérilisant. Etait généralement stipulé dans ces URS : “Un rinçage approprié” sans mention de valeur de concentration H₂0₂ en ppm. L’important était de vérifierplus la compatibilité de l’agent stérilisant avec les matériaux et de montrer une réduction de spores à 6Log dans un temps imparti que de vérifier le taux résiduel. Des taux résiduels de 5, 3 puis 1ppm ont ensuite été demandés avec un temps de rinçage rapide sans se soucier de la désorbtion des emballages en polymèreou tyvek. Néanmoins, pour atteindre ces valeurs basses de concentrations résiduelles, les temps de rinçage et d’attente peuvent être important engendrant des coûts d’immobilisation.

3. Matériels et Méthodes

3.1 Matériel utilisé

a.Isolateur utilisé

Pour ce faire trois tests de stérilité à une concentration d’H₂0₂ résiduel de 5 ppm ont été réalisés dans un l’isolateur 3 Gants intégrant un sas de bio-décontamination. Un test de référence à une concentration d’H₂0₂ résiduel de 0 ppm a également été effectué, la concentration résiduelle étant mesurée par une sonde de type (Dräger H₂0₂ LC sensor).

b. Produits à tester

Ces tests de stérilité sont réalisés sur des lingettes stériles (Référence 3035500 de Ecolab KlerwipeTM).

c. Préparation et stérilisation des milieux de culture utilisé

La stérilité de chaque lot de milieu de culture fabriqué a été assurée conformément à la norme NF EN ISO 17665-1: 2006, “stérilisation des produits de santé”. La fertilité de chaque lot de milieu de culture a été vérifiée avant utilisation en accord avec le paragraphe “fertilité des milieux” de l’essai, chap. 2.6.12 de la Pharmacopée Européenne 10^ème Edition (2020), les milieux de culture utilisés étant de la gélose Trypcase-soja, de la gélose de Sabouraud avec chloramphenicol, du bouillon à l’hydrolysat de caséine et soja, du bouillon de Thioglycolate avec résazurine.

d. Microorganismes testés et conditions de culture

Le Tableau 1 présente les microorganismes testés et leurs conditions de culture. Ces microorganismes ont été utilisés sous forme d’inocula calibré, titré entre 10 et 100 UFC.0.1ml-1, mis au point par la société ICARE. (voir Tableau1)

3.2 Méthodes

a. Préparation

Pour chaque test de stérilité ont été placé sous isolateur avant décontamination :

• 8 bocaux contenant 500 ml de bouillon à l’hydrolysat de caséine et de soja
• 8 bocaux contenant 500 ml de bouillon thioglycolate avec résazurine
• 1 paquet de 10 lingettes stériles
• 8 pinces stériles
• 1 micropipette 20-200 µl emballée en sachet stérile
• 1 boite d’embouts de micropipette 200 µl emballée en sachet stérile

Une fois ce matériel déposé, 3 indicateurs biologiques de Geobacillus stearothermophillus ATCC 7953 à 106 spores/indicateur biologique ont été placés dans l’isolateur. En effet, la Ph.Européenne 10^ème édition et l’USP 31 recommandent l’utilisation de Geobacillus stearothermophilus pour la validation de la méthode de stérilisation, car c’est la souche la plus résistante à l’H₂0₂. Elle est plus résistante que les spores de Bacillus subtilis, les Bacillus étant des bactéries gram+ aérobies qui produisent des endospores connues pour leur grande résistance à la chaleur, aux produits chimiques, à la sécheresse. Leur viabilité dans des milieux pauvres en nutriments est également bien connue. Un cycle de bio-décontamination à l’H₂0₂ de l’enceinte de l’isolateur a alors été démarré.

b. Bio-décontamination de l’isolateur

Le système de bio-décontamination utilisé pour cette étude était un générateur d’H₂0₂ de type STELEC® transformant sous forme de vapeur par effet thermique l’H₂0₂. L’agent de décontamination H₂0₂ 35% (RAIDOX) a été vaporisé via un gaz vecteur dans le volume à bio-décontaminer selon des paramètres prédéfinis intégrant le temps, la pression, le taux d’humidité, la température, le volume, le taux et la vitesse d’injection, ceci permettant d’atteindre une destruction de 6 Log sporicide. La durée de la phasede bio-décontamination pour cet essai était de 60 min.  Un enregistrement en continu des paramètres suivant via IHM (Siemens, France) a été effectué : taux d’humidité, quantité d’agent stérilisant, température d’évaporation, température de diffusion, temps de diffusion, de contact et d’aération, pression de diffusion, débit d’air de diffusion, concentration haute et basse de l’H₂0₂. Une ventilation de l’isolateur d’une durée de 10 minutes a été réalisée via un système catalytique jusqu’à atteindre la concentration cible d’H202 résiduel à tester, à savoir 5%. A la suite de ces opérations, a été réalisé un test de stérilité.

c. Réalisation du test de stérilité

Dès l’atteinte de la concentration d’H₂0₂ résiduel cible dans l’isolateur (5ppm), des tests de stérilité par ensemencement direct ont été réalisées suivant la méthodologie du paragraphe 2.6.1. de la Pharmacopée Européenne (2020) : pour chaque microorganisme testé, un bocal de milieu de culture adapté au microorganisme testé a été ouvert durant 6 secondes afin de placer une lingette stérile (= Essais), un autre bocal a été ouvert puis refermer sans placer de lingette stérile (= Témoins validation). Il est à signaler que ce temps de contact avec l’air est identique avec ce que l’on peut enregistrer lors des tests de stérilité par ensemencement direct réalisé dans les laboratoires. Pour chaque type de milieu de culture utilisé, des témoins négatifs ont été réalisés de la même manière que les Essais et Témoins validations (= Témoins négatifs essais et Témoins négatifs validation respectivement).Tous les bocaux de milieux de culture ont ensuite été refermés en attendant la ventilation complète de l’isolateur.

Lors du retour à une concentration d’H₂0₂ résiduel dans l’isolateur de 0 ppm (environ 15 minutes), des inocula calibrés des souches microbiennes à tester ont été placées dans le sas de transfert de l’isolateur, emballés dans un sac plastique stérile. Un cycle de décontamination du sas de transfert à I’H₂0₂ a ensuite été effectué avant de faire passer les inocula calibrés dans la chambre de l’isolateur. Ce cycle de décontamination a duré 75 minutes. Dix à 100 microorganismes de chaque souche microbienne à tester (confère Tableau 1) ont ensuite été inoculés, chacune dans un des bocaux de milieu de culture adapté contenant une lingette (“Essai”) et dans un récipient de milieu de culture adapté sans lingette ( “Témoin validation”). Les “Témoins négatifs essais” et “Témoins négatifs validation” n’ont pas été contaminés au moyen des inoculas calibrés.

d. Contrôles réalisés

En parallèle, pour chaque souche microbienne testée, un contrôle du nombre de microorganisme inoculé a été fait par dénombrement sur plaque de gélose adapté à chaque microorganisme (voir Tableau 1). Ceci a été réalisé en déposant sur le milieu de culture gélosé adapté (2 boîtes par souche) le volume utilisé en µl d’inocula calibré de chaque microorganisme. Pour chaque cycle de décontamination réalisé, des indicateurs biologiques de Geobacillusstearothermophilus ATCC 7953 ont été disposés dans l’isolateur afin de contrôler l’efficacité duprocédé de désinfection, ainsi qu’un indicateur biologique non exposé (témoin positif). Ces indicateurs biologiques ont été mis en culture dans des tubes de milieu liquide à l’hydrolysat de caséine et de soja (Spordex culture media, STERIS).

e. Incubation

Après réalisation des tests de stérilité par inoculation directe, les bocaux de milieux liquides ainsi que les milieux de culture gélosés ont été incubés dans des étuves à températures maitrisées, en accord avec les conditions de culture exposées dans le Tableau 1. Pour la souche bactérienne Clostridium sporogenes ATCC 11437, les milieux de culture gélosés ont été placé dans des sachets plastique fermés hermétiquement, contenant des générateurs d’anaérobiose (Kit GENbag anaer, Biomérieux) ainsi que des indicateurs d’anaérobiose (ThermoScientific).  Pour chaque cycle de décontamination réalisé, les indicateurs biologiques de Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 disposés dans l’isolateur afin de contrôler l’efficacité du procédé de désinfection, ainsi qu’un indicateur biologique non exposé (témoin positif), ont étémis en culture dans des tubes de milieu liquide à l’hydrolysat de caséine et de soja (Spordex culture media, STERIS) et incubés à 58°C ± 2°C pendant 7 jours. Après incubation, les quantités de germes inoculées à l’aide des inocula calibrés ont été déterminé par comptage sur les milieux de culture gélosé. Les bocaux de milieux de culture liquides et les cultures des indicateurs biologiques de Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 ont été examinées pour déceler les signes macroscopiques d’une prolifération microbienne (croissance microbienne en cas de présence de trouble).

4.2. Validation d’une méthode de test de stérilité dans un isolateur décontaminé à l’H₂0₂.

Valeur résiduelle après décontamination : 5 ppm.

Trois réplicats ont été réalisés. Les résultats sont reportés dans les Tableaux, 3, 4 et 5. Comme dans le cas précédent, pour chaque répétition de l’expérimentation avec une concentration résiduelle de 5 ppm d’H202 dans l’isolateur, toutes les souches bactériennes étudiées présentaient une croissance microbiologique suggérant qu’aucun faux négatif n’était généré dans ces conditions.